1896년 독립협회(獨立協會)에 가입하여 활동했고, 1898년에는 만민공동회(萬民共同會) 간부로 적극적 활동을 하다가, 그 해 말 독립협회가 강제해산될 때에는 한때 체포되기도 하였다.

독립협회 해산 후에는 선교사의 알선으로 3년간 일본과 미국을 여행하여 견문을 넓히었다. 1902년에 이상재(李商在) 민영환(閔泳煥) 이 준(李儁) 이상설(李相卨) 이동휘(李東輝) 등과 개혁당(改革黨) 운동에 참가하였다. 1904년에 일제가 러 일전쟁을 일으키고 일본군을 한국에 상륙시켜 내정에 간섭하면서 황무지 개척권을 요구하자 이를 반대하는 보안회(輔安會) 운동에 참가했고, 보안회가 해산 당하자 이상설 이준 등과 함께 그 후속단체인 대한협동회(大韓協同會)의 지방부장의 책임을 맡아 일본의 황무지 개척권요구를 저지하는데 성공하였다. 1904년 7월에 영국인 베델(earnest thomas bethell)과 합작하여 『대한매일신보(大韓每日申報)』를 창간하였다. 당시 일제의 탄압을 피하기 위하여 사장은 영국인 베델이 맡고, 총무를 양기탁이 맡았으나 실제로는 양기탁이 신문사를 총지휘하였다. 처음에는 1896년의 『독립신문』의 모범을 따라 1일 6면에 국문전용의 한글판과 영문판을 같이 수록하여 발간하다가, 1905년 8월 11일부터 국문판은 국한문혼용의 『大韓每日申報』로 바꾸고 영문판은 별도로 『korea daily news』라는 제호로 나누어 발행했으며, 뒤에 1907년 5월 7일부터 국문전용판으로서 『대한매일신보』를 역시 별도로 발행하였다. 『대한매일신보』는 공식적으로 사장이 외국인(영국인) 이었으므로 일제통감부의 「신문지법」에 의한 검열을 받지 않고 발행할 수 있었다. 이 점을 활용하여 양기탁은 1905년 11월 일제가 무력으로 고종과 대신들을 위협하여 「을사조약」을 강제 체결하고 국권을 박탈하자 이를 규탄하는 격렬한 필봉을 휘두르고 「을사조약」의 파기를 요구했으며, 장지연이 『황성신문』에 쓴 논설 「시일야 방성대곡(是日也 放聲大哭)」을 즉각 전재하고 영문판 『korea daily news』에도 영어로 번역 게재해서 세계에 알리었다.

특히 양기탁은 『대한매일신보』에서 의병운동을 상세히 보도하여 애국운동으로 높이 평가하고 의병운동을 적극적으로 지원하였다. 당시 다른 신문들은 일제의 「신문지법」의 제약 때문에 의병운동을 보도하지 못하거나 보도하는 경우에는 「폭도」라고 표현하여 비난하면서 보도하는 실정이었다. 오직 양기탁이 제작하는 『대한매일신보』만이 「의병」이라고 당당하게 호칭하면서 이를 국권회복운동으로 높이 평가하고 지원하였다. 이 때문에 양기탁이 제작하는 『대한매일신보』는 애국계몽운동 뿐만 아니라 의병운동의 대변지까지 되어 이 시기의 모든 국권회복운동의 중심적 언론기관으로 활동하였다. 1907년 1월에 대구에서 국채보상운동(國債報償運動)이 일어나자, 이를 적극 지지하고 전국적인 운동으로 확대하기 위하여 대한매일신보사 안에 국채보상지원금총합소(國債報償志願金總合所)를 개설하여 그 총무를 맡았다. 일제는 『대한매일신보』의 국권회복운동으로 양기탁을 극도로 증오하고 있었는데 국채보상운동까지 전국화하므로 이를 탄압하기 위하여 그를 근거도 없이 국채보상의연금 횡령이라는 누명을 씌워 구속하였다. 그러나 터무니없는 날조가 오래 갈 수는 없어서 대한매일신보 사장 베델이 법정에 서서 공소사실이 허위조작된 것임을 과학적으로 증거를 들어 부인함으로써 결국 양기탁은 무죄로 석방되었다.

1907년 4월에 안창호(安昌浩) 전덕기(全德基) 이회영(李會榮) 이동휘(李東輝) 이동녕(李東寧) 이 갑(李甲) 유동열(柳東說) 최광옥(崔光玉) 노백린(盧伯麟) 조성환(曺成煥) 등 동지들과 함께 국권회복을 위한 비밀결사로서 신민회(新民會)를 창립하여 총감독을 맡았다. 신민회는 전국의 주도적 애국계몽운동가 800여명을 입회시키어 한말 애국계몽운동을 실질적으로 배후에서 모두 지도하고 발전시켰다. 신민회의 본부를 대한매일신보사 안에 두고 전국적으로 신민회의 국권회복운동을 지도하고 지휘하였다. 일제의 병탄이 가까워 오자 1909년 봄에 그의 집에서 신민회 전국간부회의를 개최하고 국권회복을 위한 최고전략으로서 독립전쟁전략(獨立戰爭戰略)을 채택함과 동시에 그의 실천을 위하여 만주에 무관학교(武官學校)를 설립하여 독립군기지를 창건하고 독립군(獨立軍)을 양성할 계획을 세웠다. 이를 위하여 1910년 8월에는 자신이 직접 독립군기지 후보지를 물색하기 위하여 만주를 답사했으며, 1910년 12월에는 이동녕 이회영 등을 출발시키어 결국 독립군 기지를 개척하고 신흥무관학교(新興武官學校)를 설립하는데 성공하였다. 일제는 황해도에서 안명근(安明根)의 군자금 모금사건이 일어나자 양기탁 등의 독립군기지 창건운동과 국권회복운동을 탄압하기 위하여 1911년 1월 양기탁 등 16명을 체포하여 투옥하였다. 또한 신민회를 탄압하고 해체하기 위하여 1911년 9월에는 신민회가 일제 총독 사내정의를 암살하려고 기도했다는 소위 「사내총독암살음모사건(寺內總督暗殺陰謀事件)」이라는 것을 날조하여 신민회 회원 800여명을 체포하고, 그 중 105명에게 실형을 선고했으며 양기탁에게는 최고형인 징역 10년을 선고하였다. 양기탁 등은 완강한 공판투쟁을 전개하여 항소심에서 징역 6년을 확정 받고 4년간 옥고를 치렀다.

석방 후 1916년에 만주로 망명하여 독립운동을 위한 동지규합에 노력하다가 중국 천진(天津)에서 또다시 일본경찰에게 체포되어 고국으로 압송되어서 2년간의 유배(거주제한)에 처하여졌다. 1919년 3·1운동 후 1920년 4월에 『동아일보(東亞日報)』가 창간되자 언론계의 원로로서 유 근(柳 瑾)과 함께 그 고문으로 추대되었다. 1921년 미국의원단이 서울에 오자 일제의 방해에도 불구하고 독립요청서를 제출하여 다시 일제에게 체포되어 투옥되었으며, 복역 중 어머니 인동 장씨의 별세로 일시 가출옥된 것을 이용하여 거듭 망명을 결행해서 만주로 갔다. 1923년에 편강렬(片康烈)·남 정(南正) 등 동지들과 함께 독립군단체로서 의성단(義成團)을 조직하였는데 의성단은 봉천(奉天)의 만철(滿鐵) 병원을 습격하는 등 장춘선(長春線)일대에서 활약한 용감한 독립군 단체였다. 1925년 1월에는 김동삼(金東三) 등 동지들과 함께 의성단, 길림주민회, 광정단(匡正團), 대한군정서 등을 통합하여 독립군단체로서 정의부(正義府)를 조직하였다. 1926년 4월에는 정의부의 대표로서 소련에서 돌아 온 주진수(朱鎭洙), 천도교 혁신파인 고려혁명위원회의 김봉국(金鳳國), 형평사(衡平社)의 이동구(李東求) 등 다수의 동지들과 고려혁명당(高麗革命黨)을 조직하여 그 위원장(당수)이 되었다. 고려혁명당은 주로 정의부의 무장투쟁을 지원하였다. 양기탁은 임시정부의 국무령 또는 주석으로 몇 차례 추대되었으나 거절해 오다가 1934년 1월 임시정부 주석으로 취임하였다. 이와 동시에 그는 조선혁명당(朝鮮革命黨)의 위원장으로 추대되었다. 1937년에는 조선혁명당의 대표로서 한국국민당 및 한국독립당과 연합하여 한국광복진선(韓國光復陣線)을 결성하였다. 이렇게 조국광복을 위하여 동분서주하던 중 1938년 중국 강소성(江蘇省) 담양현(潭陽縣) 고당암(古堂庵)에서 병으로 서거하였다.

정부에서는 독립운동에 끼친 그의 공훈을 기리어 1962년에 건국훈장 대통령장을 추서하였다.